生物工程学报杂志

生物工程学报杂志2026年第4期

• 猪圆环病毒 2型疫苗应用与研究进展

  李文杰，孙毅，严伟东，何启盖，李文涛

  猪圆环病毒病(porcine circovirus associated disease, PCVAD)是一种由猪圆环病毒(porcine circovirus, PCV)引起的免疫抑制性疾病，给养猪业带来了严重的经济损失。其中，猪圆环病毒2型(PCV2)是导致该病的主要血清型，也是最常见的致病因子。PCV2感染可引起淋巴组织耗竭、免疫抑制及多系统病变，严重影响猪群健康和生产性能。迄今尚无针对PCV2的特效药物，疫苗接种仍是防控该病的首选措施。目前商品化疫苗以灭活疫苗和亚单位疫苗为主，在PCVAD防控中发挥了重要作用。近年来，随着基因工程技术的进步，病毒样颗粒疫苗、活载体疫苗、转基因植物疫苗、纳米疫苗及核酸疫苗等新型疫苗研发取得重大进展。然而，PCV2的高变异速率和新基因型的流行导致现有疫苗对新出现毒株的保护效力下降，给防控工作带来了持续挑战。本文系统综述了PCV2的病原学特征、疫苗的研发与应用现状，重点评述了新型疫苗的研发进展，并对未来疫苗研发方向提出展望，为实现PCVAD的有效防控提供了科学依据和技术参考。

• mRNA疫苗在动物疫病防控中的研究进展

  毛苗，何钟磊，王进挺，李敏，郝秀静

  mRNA疫苗作为一种新兴的防控手段，因具备高疗效、安全性好、研发周期短等特性而广受欢迎。近年来，新型冠状病毒的全球大流行极大地推动了mRNA疫苗研发的进程，同时也推动了mRNA疫苗在动物疾病预防中的研究进程。本文简要综述了mRNA疫苗的结构、功能特点，以及mRNA疫苗在病毒、细菌和寄生虫等引起的动物疫病中的研究进展，为未来动物疫病mRNA疫苗的相关研究提供了参考。

• 猪源抗菌肽的抗微生物感染与免疫调节机制

  张婷婷，潘言迪，方仁东，彭练慈

  猪源抗菌肽(antimicrobial peptides, AMPs)具有良好的抗微生物活性和多种生物学功能，在宿主先天免疫防御病原感染中发挥着重要作用。随着抗生素局限性的日益凸显，具有抗耐药性及免疫调节活性的AMPs逐渐成为研究热点，猪源AMPs作为防御病原感染的重要成员，具有开发成为抗感染药物的潜力。本文对猪源AMPs的结构与活性的关系、抗微生物和免疫调节等生物学功能的研究进展进行综述，并对其应用前景进行分析，为兽医学领域中抗感染药物的研发提供了参考。

• 人兽共患细菌病噬菌体防治研究进展与应用

  赵凤霞，纪雪，孙洋

  人兽共患病病原菌严重威胁着畜牧业的发展及人类健康。随着抗生素的广泛使用，细菌耐药性问题愈加严重，噬菌体因具有特异性强、不易产生耐药性等优势，在细菌感染的防控与治疗方面引起广泛关注。然而，噬菌体治疗在临床应用中仍存在诸多制约因素。可以从阻断传播途径入手，将噬菌体应用于防治人兽共患病病原菌的感染和传播。本文针对人兽共患细菌病噬菌体防治研究进展及应用进行简述，并对其未来发展进行展望，以期为噬菌体的防控及治疗的应用研究提供参考。

• 噬菌体在奶牛乳房炎治疗中的应用研究进展与前景展望

  汪子怡，李宏，孟克，旭日花

  噬菌体疗法因精准靶向性、高效裂解性、自我增殖性及良好生物相容性，在奶牛乳房炎治疗和耐药菌感染控制领域具有广阔的应用前景。本文综述了在利用噬菌体治疗奶牛乳房炎过程中所面临的挑战与未来前景，总结了主要乳房炎病原体(金黄色葡萄球菌、大肠杆菌等)噬菌体的分离鉴定方法以及已开展的体内(实验动物模型及奶牛)和体外(抑菌效果、细菌生物膜清除等)有效性评价研究，归纳了特定噬菌体或鸡尾酒制剂在控制目标病原体方面的效果，阐述了噬菌体基因组学分析在理解裂解机制、评估潜在毒力/溶原性基因中起的关键作用。同时，深入探讨了该领域当前面临的挑战，包括噬菌体宿主范围相对狭窄、体内药代动力学及给药方案优化困难、规模化生产与稳定性问题等。尽管挑战众多，但是噬菌体工程改造、噬菌体-抗生素协同应用、新型递送系统(如纳米载体)等创新方向仍为未来发展提供了重要研究思路。本文为噬菌体疗法在奶牛乳房炎防控中的进一步研究与应用提供了理论依据和实践参考，推动该绿色治疗策略向临床转化。

• 产气荚膜梭菌致病机制及防控研究进展

  陈佳琦，马藤菲，杨少华，朱迪迪，葛传辉，邱建华，杨宏军

  产气荚膜梭菌( Clostridium perfringens, CP)作为革兰氏阳性厌氧梭菌，是广泛存在于土壤、水源和食物中的重要人兽共患病原体，对公共卫生安全与畜牧养殖业构成严重威胁，可引发气性坏疽、坏死性肠炎等多种高致死性疾病，造成重大经济损失。本文系统综述了该菌的生物学特性、致病机制、流行病学特征、检测方法及防控策略，为相关感染的防治提供了理论依据与实践参考。

• 纳米孔测序技术在骨骼肌RNA修饰与剪接中的应用

  刘博平，杨瑞，史新娥，靳建军

  RNA可变剪接和化学修饰是转录后调控的关键机制，能够调节RNA结构、定位、稳定性、翻译及蛋白质的表达水平和多样性，对细胞命运与生命活动具有重要影响。在肌肉组织中，这些机制对于肌生成、肌纤维类型分化、能量代谢调控及肌肉对环境胁迫的适应尤为重要。近年来，肌肉发育及相关疾病(如肌肉萎缩、代谢紊乱和应激损伤)中可变剪接事件的异常调控及表观转录组修饰的功能作用逐渐受到广泛关注。精准鉴定RNA的修饰和可变剪接变化，对于解析肌肉生物学的精细调控机制及推动畜禽肌肉产性状改良具有重要意义。第三代测序技术，尤其是纳米孔测序技术(nanopore sequencing technology)，凭借其读长优势和原始信号可直接获取修饰信息的特点，正推动RNA剪接与修饰研究进入新阶段。配套的生物信息学工具如Bonito、Nanopolish、DeepSignal和m⁶ATM等，在碱基识别、修饰检测和异构体解析方面不断优化，极大地提升了数据解析的分辨率与准确性。本文综述了RNA剪接与修饰的基本机制与研究进展，重点讨论了纳米孔测序技术及其在表观转录组学中的应用前景，特别强调了其在肌肉发育研究与肌肉相关疾病诊断中的潜在价值；总结纳米孔测序技术及其相关生物信息学方法在表观转录组学研究中的应用优势与挑战，为后续相关研究的技术选择、方法优化及功能机制探索提供了参考，并为肌肉发育及肌肉相关疾病研究的深入开展奠定了理论基础。

• 耐镉脱氮微生物胁迫响应机制及废水处理应用研究进展

  周熹，赵天涛，邢志林

  在电池生产、金属冶炼和电镀等工业生产过程中产生的废水同时含有高浓度镉和氮，会形成镉-氮复合污染。针对该类废水中同步去除镉、氮的难题，传统物理化学处理方法存在工艺复杂、能耗高、易产生二次污染等局限。相比之下，利用耐镉脱氮微生物，通过吸附、生物矿化等途径实现镉-氮协同去除，表现出低能耗与高效性的优势。本文综述了耐镉脱氮微生物的分类与脱氮特性，重点分析了以假单胞菌属为代表的该类微生物的耐镉机制及脱氮性能；系统分析了镉对脱氮过程的抑制效应及其分子机制；归纳了微生物在镉胁迫下的响应机制和除镉途径；并概述了功能菌株在不同反应工艺中实现镉-氮协同去除的研究进展，总结了生物膜与固定化床反应器通过生物矿化及复合载体构建在提升污染物去除效率与系统稳定性方面取得的成果。最后，基于研究现状分析了存在的问题与局限性，并对未来的研究方向进行了展望，为镉-氮复合污染废水的生物治理提供了理论与实践参考。

• 游离氨促进污水污泥厌氧发酵实现资源化和无害化研究进展

  王正江，李振轮

  直接通过厌氧发酵污泥来获取短链脂肪酸、氢、甲烷等高附加值物质以及同步去除污泥中的硫化氢、病原体、抗性基因等危害物的效率低下。游离氨(free ammonia, FA)作为一种可从污水处理系统内部获得的物质，具有环保、经济、可持续的特点，在实现污泥资源化、无害化方面表现出良好前景。本文系统地综述了FA预处理在促进污泥厌氧高效资源化和无害化这2个方面的研究成果，并阐述了此过程的关键影响因素，总结了其内在作用机理，并从能耗、经济以及环境角度评估了FA技术的综合效益，为经济、环保且可持续的污泥管理方案提供了理论依据和技术参考。

• 污水中磺胺类抗生素的污染现状与生物降解研究进展

  王誉，张云飞，井媛，田永兰

  磺胺类抗生素(sulfonamides, SAs)在自然水体、沉积物和污水处理厂中检出率高，长期存在会诱导抗性基因和耐药菌的产生和传播，对生态系统和公共健康构成威胁。我国城镇污水处理厂现有工艺难以实现对SAs的有效削减。本文基于近年来国内外学者在SAs检出浓度、生物毒性、诱导抗性基因转移等方面的研究进展，结合本课题组开展的SAs降解技术与机制研究方面的工作，总结了污水中SAs的污染现状和危害、生物降解工艺、关键影响因素，阐明了生物群落协作、微生物共代谢、真核生物酶解、肠道菌群与宿主互作等在SAs降解和抗性基因(antibiotic resistance genes, ARGs)水平转移控制过程中的作用原理，梳理了代表性SAs的降解路径、降解动力学和相关研究方法，并从组合工艺创新、多因素协同影响机制、真核生物及其微生物组互利协作等方面对未来研究方向进行了展望，为SAs降解机理的深入研究和污染治理提供参考。

• 牛干扰素-γ高效无细胞表达系统建立及其功能活性表征

  谢莹影，葛家振，王文浩，刘新苗，李仁阁，郭双双，王梓晴，宋国栋，宋银娟，孙坚，郑福英，储岳峰

  本研究旨在优化pET-23b质粒结构以增加无细胞系统表达牛干扰素-γ (interferon-gamma, IFN-γ)的产量。首先利用生物信息学的方法对牛IFN-γ基因进行稳定性突变，对携带优化后的牛IFN-γ基因的原始质粒origin-pET-23b-IFN-γ通过重叠PCR删除质粒中的rop片段、bom片段和f1 ori片段，构建了高拷贝数m-pET-23b-IFN-γ质粒。用m-pET-23b-IFN-γ质粒进行大肠杆菌无细胞体系表达。经Western blotting分析，表达的牛IFN-γ蛋白具有良好的反应性，并且表达量高于未改造的pET-23b无细胞表达系统。将无细胞表达体系反应的产物离心后取上清，使用His标签蛋白纯化琼脂糖磁珠试剂盒对上清中的His标签蛋白进行纯化，对纯化后的重组牛IFN-γ (rIFN-γ)进行细胞安全性评估、抗牛分枝杆菌的生物活性测定及细胞干扰素刺激基因(interferon-stimulated genes, ISGs)转录水平的定量实时聚合酶链式反应(quantitative real-time PCR, qPCR)测定。结果表明牛IFN-γ在浓度低于100 μg/mL时对细胞几乎无毒性，并且具有抗牛分枝杆菌的活性，ISGs转录水平均升高，说明重组牛IFN-γ具有良好的生物学活性。本研究成功建立了高效无细胞牛IFN-γ表达系统，为牛结核病的诊断与治疗提供了高效、安全的牛IFN-γ生产途径，展现出了广阔的应用前景。

• 产气荚膜梭菌毒素重组表达与单克隆抗体制备

  黄紫贝，苏思元，王海燕，刘文博

  本研究旨在构建产气荚膜梭菌6种主要毒素的原核表达系统，制备特异性单克隆抗体，为相关毒素检测及疾病早期诊断提供可靠的实验依据。克隆产气荚膜梭菌6种主要毒素基因，构建重组融合蛋白表达载体，进行原核表达及纯化。以纯化的重组蛋白作为免疫原，免疫动物后多轮筛选获得单克隆抗体杂交瘤细胞株。Western blotting验证抗体对重组蛋白及天然毒素的特异性识别能力。成功构建并表达了6种主要毒素的重组融合蛋白，获得3株功能稳定的单克隆抗体杂交瘤细胞株，分别为3B10 (针对CPA毒素)、10E9 (针对ETX毒素)及5F9 (针对NetB毒素)。Western blotting结果表明，所制备抗体能够特异性识别重组蛋白及天然毒素，且免疫反应性良好。本研究成功表达了主要毒素并制备了针对3种毒素的特异性单克隆抗体，为相关毒素的快速检测及山羊产气荚膜梭菌病的早期诊断研究提供了生物材料，具有重要的潜在应用价值。

• EGFP蛋白单克隆抗体的制备及特性分析

  朱昱茜，何印娣，石正旺，罗俊聪，席韬，张帆，石鑫泰，李帅鹏，郑海学，田宏

  为制备高特异性和亲和力的EGFP单克隆抗体(monoclonal antibody, mAb)，本研究以纯化的EGFP蛋白为抗原，经弗氏佐剂乳化后免疫Balb/c小鼠，将小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合，应用间接ELISA方法筛选阳性孔并利用有限稀释法进行亚克隆，获得稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株。采用叠加试验、亚型鉴定、Western blotting及表面等离子体共振(surface plasmon resonance, SPR)技术，系统分析抗体的表位特异性、反应性及亲和力。结果发现，本研究成功筛选出2株能稳定分泌特异性针对EGFP蛋白单抗的杂交瘤细胞株1F11和3C11，其亚型分别为IgG2a和IgG2b；叠加试验显示叠加系数(additivity index, AI)大于40%，说明两者识别不同抗原表位；抗体效价检测发现效价均可达1:512 000；Western blotting分析证实其可特异性识别大小约为27 kDa的EGFP蛋白；SPR分析测得亲和力常数分别为3.806×10 ^-10 mol/L和2.631×10 ^-10 mol/L，均属于高亲和力水平。由此可见，本研究制备的mAbs具有良好的特异性、反应性及高亲和力，为EGFP标记蛋白的免疫学检测及疫苗株体内监测提供了特异性的重要生物工具。

• HSD3B7基因对牛卵泡发育的调控作用及其机制

  成俊丽，韩俊，闫俊蓉，朱芷葳，李鹏飞

  本研究旨在探究3β-羟基-Δ⁵-C₂₇-类固醇氧化还原酶(3β-hydroxy-Δ⁵-C₂₇-steroid oxidoreductase, HSD3B7)对牛卵泡发育的调节作用及其机制。构建敲降和过表达HSD3B7基因的牛原代颗粒细胞(granulosa cells, GCs)，用细胞计数试剂-8 (cell counting kit-8, CCK-8)法检测GCs增殖效率，用Annexin V-EGFP/PI双染法检测GCs凋亡水平，用酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)技术检测培养液中雌二醇(estradiol, E₂)和胞内2-甲氧基雌酮的浓度，用实时荧光定量PCR (real-time quantitative-polymerase chain reaction, qRT-PCR)技术检测CCND2、Bim、Caspase-3、CYP19A1、STAR的相对表达水平，用Western blotting技术检测相关基因蛋白水平的表达情况。结果显示，HSD3B7敲降后降低了牛卵泡原代GCs增殖效率和CCND2蛋白的表达水平；促进了GCs凋亡和Bim蛋白、Caspase-3蛋白的表达；减少E₂的分泌量和CYP19A1蛋白、STAR蛋白的表达量；增加E₂主要代谢物2-甲氧基雌酮的浓度。HSD3B7过表达后取得相反结果。本研究结果表明，HSD3B7通过促进牛GCs增殖和E₂分泌、抑制GCs凋亡，正向调控牛卵泡发育进程。研究结果为深入解析牛卵泡发育的分子调控网络提供了新的理论依据，也为提高牛繁殖效率的相关研究和实践应用奠定了基础。

• 牦牛ERBB2基因的克隆及其在不同发情周期输卵管中的表达分析

  汪丸淑，王国升，王新宇，柯鑫，吴小蝶，杨小耿，何翃闳，王冰洁，李键，张慧珠

  本研究旨在探究表皮生长因子受体2 (erb-b2 receptor tyrosine kinase 2, ERBB2)基因的分子结构特征及其在牦牛不同发情周期输卵管不同部位中的表达情况。采集牦牛输卵管组织样品，对牦牛ERBB2基因编码区序列(coding sequence, CDS)进行克隆，分析ERBB2的理化性质等；应用实时荧光定量PCR (real-time fluorescence quantitative PCR, RT-qPCR)检测ERBB2基因在牦牛发情周期不同时期输卵管各段中的表达情况；应用蛋白免疫印迹法(Western blotting, WB)和免疫组织化学法(immunohistochemistry, IHC)检测发情周期不同时期输卵管各部位中ERBB2蛋白的表达。结果显示，牦牛ERBB2基因编码区片段大小为3 768 bp，共编码1 255个氨基酸，与黄牛的亲缘关系最近，与骆驼亲缘关系最远。牦牛ERBB2蛋白属于亲水性蛋白，ERBB2基因编码蛋白分子式为C₆₄₆₄H₁₀₁₄₅N₁₈₁₅O₁₉₃₁S₈₁，相对分子质量146 kDa，其二级结构以不规则卷曲为主。该基因在卵泡期和黄体期这2个时期的输卵管各段中的表达存在差异，可能参与精卵结合以及胚胎发育等生殖过程。本研究为进一步研究ERBB2在雌牦牛繁殖中的功能和分子机制提供了理论依据。

• 猪流行性腹泻病毒通过诱发宿主细胞葡萄糖代谢重编程促进自身复制

  陈雪清，王公民，马畅，伍钢，徐佳靖，陈希文，张源淑

  为探究猪流行性腹泻病毒感染如何诱发宿主细胞葡萄糖代谢的重编程以及对其复制的作用，本研究通过猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)感染猪小肠上皮细胞(intestinal porcine epithelial cell-J2, IPEC-J2)建立宿主细胞模型，并分别设置对照组和感染组。首先通过观察PEDV感染滴度和N蛋白的表达来明确病毒的感染时间和剂量；然后通过蛋白组学比较分析PEDV感染细胞中富集的差异蛋白、关键蛋白以及关键代谢通路等；通过RT-qPCR和Western blotting验证PEDV感染细胞中糖酵解和三羧酸循环(tricarboxylic acid cycle, TCA cycle)途径中关键酶的蛋白或基因表达；最后通过检测细胞中葡萄糖、ATP、乳酸的含量以及葡萄糖转运蛋白SGLT-1、GLUT-2和PEDV N蛋白的表达来明确PEDV诱导的糖酵解变化对其复制的影响。结果表明，PEDV感染IPEC-J2的最佳时间为48 h，感染复数(multiplicity of infection, MOI)为1。蛋白组学结果显示有342个差异蛋白被筛选出来并且主要富集在糖酵解、碳水化合物的消化和吸收以及脂质代谢等途径。其中，PEDV感染显著或极显著上调IPEC-J2中糖酵解关键酶HKII (P<0.05)、LDHA、PKM (P<0.01)的蛋白表达水平，极显著上调PFK的编码基因转录水平(P<0.01)；而三羧酸循环途径关键酶CS、OGDH、IDH编码基因的转录水平均极显著下调(P<0.01)。PEDV感染还导致细胞内的乳酸含量显著升高(P<0.01)，ATP含量极显著降低(P<0.01)；葡萄糖转运蛋白SGLT-1和GLUT-2的表达水平分别显著、极显著上调(P<0.05、P<0.01)。糖酵解抑制剂2-脱氧-d-葡萄糖(2-deoxy-d-glucose, 2-DG)预处理IPEC-J2能够显著降低胞内PEDV N蛋白的表达(P<0.05)。本研究表明，PEDV感染可以诱发宿主细胞发生葡萄糖重编程并增强病毒的复制能力，表现为糖酵解途径激活，TCA循环及氧化磷酸化作用受阻。其机制是通过促进葡萄糖摄取、上调糖酵解途径关键酶的表达，并通过诱导这种糖代谢的重编程变化，促进其在宿主细胞中的高效复制。本研究证实PEDV感染可诱导宿主细胞葡萄糖代谢重编程，通过激活有氧糖酵解促进自身复制，为靶向治疗和预防PEDV感染提供了新的思路和途径。

• 赤羽病病毒GZTS-1株在Vero细胞中增殖动态观察

  周学慧，刘言言，左妤祺，刘霞，赵治国，王艳，赵腾龙，唐东，杨晓伟，赵光伟

  为了解赤羽病病毒(Akabane virus, AKAV)对Vero细胞的致病性及其增殖过程，本研究利用基因Ⅱ型AKAV毒株GZTS-1对Vero细胞进行感染，测定其增殖滴度，利用荧光定量PCR方法对感染后不同时间点细胞上清液中病毒的拷贝数进行检测，细胞经间接免疫荧光方法染色后通过荧光显微镜和激光共聚焦显微镜观察其增殖情况。结果发现，AKAV GZTS-1株对Vero细胞可产生明显细胞病变(cytopathic effect, CPE)，病毒滴度总体呈现上升趋势；荧光定量PCR结果显示感染细胞上清中AKAV的拷贝数呈现2次显著下降又上升的趋势，感染后24 h显著下降随后上升，至48 h达到高峰，随后下降并在72 h降至最低，此后上升并在84 h和96 h时维持较高水平；荧光显微镜和激光共聚焦显微镜观察显示，接毒后6 h开始出现微弱的荧光并持续至18 h，24 h时开始出现较强的荧光点，但荧光信号分布范围有限，随后荧光的面积逐渐增大，至72 h时出现大片弥散性荧光点并持续至96 h，荧光强度达到最高。本研究结果为后续AKAV疫苗的开发及病毒致病机制研究等奠定了基础。

• 表达猪瘟病毒 E2蛋白重组乳酸乳球菌的构建及其在小鼠中的免疫原性评估

  赵永聪，马中元，张中旺，吕建亮，张莉萍，于瑞明，兰喜，郭慧琛，潘丽，刘新生

  猪瘟病毒(classical swine fever virus, CSFV)主要通过呼吸道和消化道感染猪，给全球养猪业造成了巨大的经济损失。sIgA介导的黏膜免疫反应对于抵御CSFV早期入侵至关重要，本研究旨在利用乳酸乳球菌为载体研制口服疫苗，通过诱导黏膜免疫产生sIgA，从而阻断CSFV的早期入侵，为适应现代化猪场的大规模、无应激免疫提供新的技术手段。首先通过荧光素酶活体成像技术和粪便菌落计数评估乳酸乳球菌NZ9000在小鼠体内的定植能力，随后利用同源重组技术构建菌体表面展示CSFV E2蛋白的重组乳酸乳球菌NZ9000/pNZ8148- pgsA- E2以及胞内表达E2蛋白的重组乳酸乳球菌NZ9000/pNZ8148- E2。重组菌株经免疫印迹和间接免疫荧光鉴定目的蛋白E2的表达，随后评价重组菌株在小鼠体内的免疫原性。结果表明，乳酸乳球菌NZ9000可在小鼠体内短暂定植。NZ9000/pNZ8148- pgsA- E2与NZ9000/pNZ8148- E2分别实现了目的蛋白的表面展示与胞内表达。经灌胃免疫小鼠后，2种重组菌株均能有效诱导小鼠产生特异性免疫应答；表面展示型重组菌在诱导Th1型细胞因子分泌及CD4? T细胞活化方面比胞内表达型重组菌更具优势。本研究成功构建了表达猪瘟病毒E2蛋白的重组乳酸乳球菌，为开发防治猪瘟的黏膜免疫疫苗提供了实验依据。

• 缺氧模拟剂CoCl2重塑猫间充质干细胞外泌体蛋白质组成

  楼姣，陈海燕，冯恩惠，李伟娜，陈盼龙，陈云龙，樊心怡，许景美，方平，王妍，卢德章，张仕强

  本研究旨在揭示低氧预处理对猫脂肪间充质干细胞(adipose-derived mesenchymal stem cells, ADMSCs)外泌体蛋白质组成的重塑作用及潜在应用。探讨了低氧预处理猫ADMSCs来源外泌体的蛋白质组特征及其生物学功能，通过CoCl?模拟低氧环境处理ADMSCs，采用差速超速离心法分离外泌体，经透射电镜、纳米颗粒追踪分析和蛋白质印迹鉴定其物理特性。蛋白质组学分析显示，低氧预处理诱导外泌体蛋白质组发生显著改变，共鉴定出120个差异表达蛋白质(116个上调、4个下调)。生物信息学分析表明，差异蛋白质显著富集于低氧诱导因子-1 (hypoxia-inducible factor-1, HIF-1)信号通路、腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine monophosphate-activated protein kinase, AMPK)信号通路、自噬和蛋白酶体功能等关键通路。基因本体(gene ontology, GO)功能注释显示，低氧预处理组代谢过程、细胞周期调控和信号转导等生物学过程显著富集。京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG)分析进一步揭示其可能通过调控细胞周期、肾素-血管紧张素系统等多条通路发挥生物学功能。值得注意的是，差异蛋白质中HMOX1、TFRC等低氧应答蛋白质表达上调，而肾素-血管紧张素系统相关通路受到抑制。本研究首次系统阐明了低氧预处理对猫ADMSCs来源外泌体蛋白质组的重塑作用，为深入理解外泌体介导的细胞间通讯提供了新的理论基础。

• 猪子宫脱细胞基质水凝胶及其微阵列对猪子宫内膜基质细胞行为的调控

  娄佳欣，宋玉，邱欣娜，程媛，于悦，娄志奇，刘忠华，颜廷胜

  猪子宫脱细胞外基质(decellularized extracellular matrix, DECM)水凝胶是子宫内膜组织工程的理想候选材料，但其脱细胞效率与细胞外基质(extracellular matrix, ECM)活性保留常受限。为探究DECM水凝胶的生化和力学特性对子宫内膜基质细胞(porcine endometrial stromal cells, pESCs)的调控机制，改善传统工艺中脱细胞效率与ECM活性的矛盾，本研究优化了猪子宫DECM水凝胶制备工艺：采用冻融联合SDS/Triton X-100脱细胞法，经正交实验确定最佳胃蛋白酶消化参数(72 h, 4 ℃, 10 mg/mL)，显著提升了脱细胞效率(P<0.001)并完整保留了胶原、糖胺聚糖、生长因子及多孔结构(经蛋白组学与扫描电镜结果证实)。鉴于纯DECM力学性能不足，开发了0.5% DECM+5%甲基丙烯酰化明胶(methacryloyl gelatin, GelMA)复合水凝胶，其弹性模量接近天然子宫内膜(P<0.001)，且降解稳定性与溶胀比更优。细胞研究表明，高DECM含量通过整合素α5β1-FAK通路促进pESCs迁移与聚集体自组装。针对传统培养的局限，构建了半球形/圆柱形DECM-GelMA复合微阵列，利用接触引导效应成功诱导细胞定向生长。本研究实现了DECM高效制备与生物活性协同优化，阐明了其通过整合素信号及细胞骨架重构调控细胞行为的机制，为仿生子宫内膜支架开发提供了新策略。

• gM囊泡的表征鉴定及成分分析

  张成州，贾万欣，李佳瑶，张艳楠，王世民

  马疱疹病毒-1型(equine herpesvirus-1, EHV-1) gM基因的羧基端可诱导哺乳动物细胞产生能够负载或展示靶蛋白质的囊泡(gM囊泡)，有望应用于药物靶向递送、基因治疗及囊膜化病毒样颗粒疫苗研发等领域。为了研究该囊泡的形成机制、结构构成及生物学功能，本研究使用免疫亲和技术纯化gM囊泡，通过透射电子显微镜(transmission electron microscope, TEM)、纳米颗粒跟踪分析技术(nanoparticle tracking analysis, NTA)对纯化的gM囊泡的形态、数量及Zeta电位进行分析；同时，利用蛋白质质谱技术(liquid chromatography-tandem mass spectrometry, LC-MS/MS)鉴定gM囊泡的结构蛋白，并对蛋白质鉴定结果进行基因本体(gene ontology, GO)功能注释和KEGG (Kyoto encyclopedia of genes and genomes)代谢通路分析。结果显示，gM囊泡直径分布在100?300 nm之间，其平均直径约(151.3±5.7) nm；囊泡Zeta电位为?32.579 mV；纯化囊泡总量可达3.85×10⁵ particles/mL细胞；利用蛋白质质谱技术共鉴定出416种蛋白质，去除无注释的蛋白后保留396种蛋白质用于后续分析；通过GO及KEGG分析，gM囊泡共参与了4条与囊泡形成及运输过程相关的代谢通路，分别为囊泡介导的运输、内吞作用、内质网与高尔基体间的运输和内质网中的蛋白质加工。本研究通过蛋白质谱鉴定分析从蛋白质水平上揭示了gM囊泡的形成机制，为gM囊泡在工程化改造、胞内调控机制、药物递送靶向治疗等领域的研究及应用奠定基础。

• 羊副流感病毒3型N蛋白原核表达及双抗原夹心ELISA方法的建立

  杨倩倩，廖焕程，石正旺，罗俊聪，陈婕，张帆，王琳，谢亚格，周正，武嘉惠，田宏，郑海学

  本研究旨在建立一种双抗原夹心ELISA方法，用以检测羊副流感病毒3型血清抗体，以支持羊副流感病毒3型血清抗体感染临床诊断。合成N基因(NCBI数据库登录号：MT756864.1)并构建至pET-30a中，命名为pET-30a-N，利用大肠杆菌原核表达、亲和层析纯化N蛋白。用间接ELISA方法和Western blotting方法验证N蛋白反应性。用凝血酶(1:1 000，W/W)酶切N蛋白His标签。通过优化抗原包被浓度、酶标抗原稀释比例、血清稀释比例等条件，最终建立用于检测临床样本羊副流感病毒3型血清抗体的双抗原夹心ELISA方法。结果发现，间接ELISA方法和Western blotting方法鉴定N蛋白具有良好的反应性。N蛋白His标签成功切除，且酶切后的N蛋白反应性未改变。通过棋盘法得到最佳抗原包被浓度为0.5 μg/mL；HRP酶标抗原稀释度为1:10 000；血清最佳稀释比例1:20；双抗原夹心ELISA临界值为0.237；与口蹄疫病毒O型(foot-and-mouth disease virus, FMDV-O)、羊痘病毒(sheep/goat pox virus, GTPV)、羊口疮病毒(orf virus, ORFV)、布鲁氏菌(Brucella)的抗体阳性血清均无交叉反应，与商品化试剂盒相比较敏感性高达1:512；批间和批内的变异系数均小于10%。用本研究建立的方法与圣博羊间接ELISA试剂盒同时对150份田间羊临床血清进行检测，两者的符合率为87%。本研究所建立的双抗原夹心ELISA方法具备特异性强、敏感性高、重复性好等特点，为羊副流感病毒3型血清抗体大规模样品监测、血清学调查、疫病防控提供了有效的技术手段。

• 猪伪狂犬病病毒gB抗体检测的胶体金免疫层析试纸条研制

  王琳，石鑫泰，石正旺，廖焕程，罗俊聪，陈婕，朱昱茜，谢亚格，杨倩倩，周正，田宏

  本研究旨在建立一种检测猪伪狂犬病病毒(porcine pseudorabies virus, PRV) gB蛋白抗体胶体金免疫层析试纸条，为PRV gB抗体检测提供一种简单快速的检测技术。本研究通过杂交瘤技术制备gB蛋白单克隆抗体，将gB蛋白与胶体金偶联，再将gB蛋白及其单克隆抗体分别喷涂在硝酸纤维素膜上作为检测线和质控线，经一系列条件的优化，成功制备了检测PRV gB抗体的胶体金免疫层析试纸条，并对该试纸条的特异性、敏感性、稳定性和符合性进行验证。结果发现，该试纸条的敏感性为1:128；与猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)、猪瘟病毒(classical swine fever virus, CSFV)、塞内卡病毒(senecavirus A, SVA)、口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus, FMDV)阳性血清均无交叉反应；在37 ℃可耐受至少72 d；通过检测96份临床猪血清样本，发现与商品化ELISA试剂盒检测结果的符合率为92.71%。本研究制备的PRV gB抗体胶体金免疫层析试纸条特异性好、灵敏度高、结果易判定，适用于猪伪狂犬病基层现场快速检测。

• 基于酶促重组等温扩增与 CRISPR/ EsCas13d 技术构建的猪圆环病毒 4型快速可视化检测方法

  徐通，赵磊，戴阳明，段佳琪，王圆梦，邵丽娜，陈弟诗，朱玲，徐志文

  人类与动物传染病在全球范围内持续暴发，严重威胁公共卫生安全并影响经济发展，因此亟需更加高效、灵敏的诊断方法来提升疫情监测与预警能力。本研究旨在开发一种基于ERA-CRISPR/ EsCas13d的便携式可视化平台，于资源有限的环境中实现对猪圆环病毒4型的快速检测。对该平台进行了体系优化，使酶促重组等温扩增技术(enzymatic recombinase amplification, ERA)、T7转录以及CRISPR/ EsCas13d切割反应能够在单管内连续完成，极大简化了操作流程，并将总检测时间缩短至30 min。同时，配套的快速核酸释放方法无需实验室提取及复杂的加热步骤，进一步提升了平台的简便性与实用性。采用改良的冻干试剂，降低了冷链运输和储存需求，简化了制备流程，便于实现低成本运输与现场部署。该方法可灵敏检测猪圆环病毒4型，可视化检测限为50 cp/μL；在特异性评价中，对其他6种常见猪病原均未检测到信号(均为阴性)。此外，本平台支持紫外光(470 nm)和侧向层析试纸条(lateral flow assay, LFA) 2种可视化读数方式，能够在不同应用场景下灵活判读。通过对60份临床样本的验证，检测结果与荧光定量PCR符合率为100%，充分展示了ERA-CRISPR/ EsCas13d便携式可视化平台在现场快速检测与便携式诊断中的应用前景与实用价值。

• 基于实时荧光重组酶聚合酶扩增的鸭瘟强毒株感染快速检测方法的建立

  万佳欣，朱寅初，徐杏，王星博，周卫东，吴越

  鸭瘟病毒(duck enteritis virus, DEV)是一种常见的疱疹科病毒，可引起禽类急性、热性、败血性传染病，造成家禽养殖业巨大的经济损失。因此，迫切需要对鸭瘟病毒进行高效、灵敏的现场快速检测。以DEV的UL2基因保守片段为靶基因，设计特异性重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification, RPA)引物和探针，优化RPA反应条件后，建立DEV的荧光RPA恒温快速检测方法。结果证明，该检测方法最佳反应温度为40 ℃，最佳反应时间为20 min，对鸭瘟强毒株的最低检测限为2 fg/反应；仅特异性扩增DEV强毒株，与其他常见鸭病病原如鸭肝炎病毒、鸭坦布苏病毒等均无交叉反应。采用建立的实时荧光RPA检测方法和实时荧光定量聚合酶链式反应(quantitative real-time polymerase chain reaction, qPCR)对36份鸭组织临床样本进行检测，结果显示RPA检测敏感性为100%，特异性为100%，准确率为100%。本研究建立的DEV强毒实时荧光RPA检测方法，具有检测速度快、灵敏度高、特异性强等特点，为鸭瘟疫病的现场快速检测提供了一种可行的途径。

• 聚苯乙烯纳米塑料通过吸附载脂蛋白E扰乱巨噬细胞胆固醇代谢

  李傲，刘紫佳，赵子杰，郑雨晨，李文卓，宁云路，周志祥

  本研究旨在探究污染物纳米塑料(nanoplastics, NPs)对人体健康的潜在危害及其分子机制。聚苯乙烯纳米塑料(polystyrene nanoplastics, PS-NPs)在环境中广泛存在并可进入人体，与心血管疾病风险密切相关，但其对胆固醇代谢的影响尚未明确。本研究通过蛋白质组学技术分析发现，PS-NPs与巨噬细胞相互作用后，可特异性吸附1 676个蛋白质；生物信息学分析表明，这些吸附蛋白显著富集于胆固醇代谢通路，其中对载脂蛋白E (apolipoprotein E, APOE)的吸附最为突出。进一步的分子对接和分子动力学模拟显示，聚苯乙烯分子能够通过竞争性结合APOE的关键氨基酸残基(如LEU-202、TRP-228)，抑制其与胆固醇的相互作用。细胞实验证实，100 μg/mL PS-NPs暴露24 h可显著诱导巨噬细胞内脂质蓄积。本研究从分子互作层面揭示了PS-NPs通过干扰APOE功能影响脂质代谢的新机制，为阐明其促动脉粥样硬化发生的毒理机制提供了关键证据，对评估其健康风险具有重要科学意义。

• 顺铂暴露诱导斑马鱼免疫毒性效应

  吴昊，邓智慧，王慧利，钱秋慧

  顺铂(cisplatin, CDDP)作为临床上广泛应用的抗肿瘤药物，其环境残留对水生生物的免疫毒性机制尚未阐明。本研究旨在评价环境相关浓度CDDP对斑马鱼的免疫毒性效应，并验证NF-κB信号通路在其中的介导作用。为此，本研究以斑马鱼为模式生物，系统研究了CDDP暴露对免疫系统的毒性效应。结果表明，CDDP暴露显著降低了斑马鱼的生存率与孵化率，半数致死浓度(median lethal concentration, LC₅₀)为0.48 mg/L，并诱导幼鱼出现发育迟缓、眼球缩小等畸形，同时导致自主运动减退和光暗节律紊乱。在氧化应激层面，CDDP促进活性氧(reactive oxygen species, ROS)与丙二醛(malondialdehyde, MDA)积累，伴随谷胱甘肽(reduced glutathione, GSH)含量及过氧化氢酶(catalase, CAT)活性下降，提示抗氧化防御受损。免疫学检测显示，CDDP暴露引起巨噬细胞与中性粒细胞异常募集，补体C3 (complement C3, C3)水平异常，免疫球蛋白M (immunoglobulin M, IgM)持续抑制。长期暴露亦导致成年斑马鱼肾功能相关指标异常。机制研究表明，CDDP可显著上调NF-κB信号通路关键基因，驱动过度免疫炎症反应。上述效应即使在0.025 mg/L环境浓度下仍可观察到。本研究为揭示CDDP的环境生态风险及免疫毒性作用机制提供了理论支撑。

• 电场强度对堆肥过程细菌群落结构、网络拓扑与表型的影响

  张利萍，常远，胡天乐，马宏芳，苗楠楠，张陇利，魏雨泉，李季

  为缓解好氧堆肥早期传质受限与局部缺氧导致的升温滞后与高温期不足，厘清电场介入对微生物生态网络与功能表型的影响，本研究设置不同强度(0 V、2 V、5 V)的电场施加于30 L反应器的堆肥过程，结合理化指标、16S rRNA细菌群落结构分析、共现网络与BugBase表型预测，解析电场堆肥下微生物群落组成与功能演替机制。研究结果显示：电场能够显著加速升温并延长高温期，前期电流与温度呈紧密耦合；堆肥时间是细菌群落结构的主要影响因素，但在控制时间后，电场效应依旧显著，且在第7天和第18天形成了显著分化的群落结构。属水平上，电场富集了与电子转移/发酵相关的关键类群，例如假单胞菌属(Pseudomonas)、嗜蛋白质菌属(Proteiniphilum)、拟杆菌属(Bacteroides)、甲烷粒菌属(Methanocorpusculum)、消化球菌属(Peptococcus)等，富集了发酵菌和电活性菌；网络结构由“低聚集、短路径”重组为“高聚集、长路径”，电场改变了优势菌与连接者的模块归属和相对位置，弱电场增强跨模块协同，强电场强化模块分区与枢纽连接。BugBase表型层面呈现阶段性迁移，且5 V电场对细菌表型谱的调控效应更强、更早出现。电场处理组更倾向于富集需氧型、革兰氏阴性、生物膜形成与应激耐受等表型，同时革兰氏阳性表型倾向降低。综上，电场通过改善微尺度传质与电子受体可用性，放大了前期代谢与放热过程，微生物网络结构重组，实现了“加速而不改向”。本研究阐明了电场调控好氧堆肥进程的微生物生态学机制，为通过物理场精准调控菌群功能、定向优化堆肥工艺提供了新的理论与技术路径。

• 不同电子供体驱动反硝化的效能及微生物响应特征

  周文，张列宇，田振军，高生旺，杜彩丽，柏杨巍，卫毅梅

  有机废弃物水解酸化过程中产生的小分子物质可作为反硝化电子供体，但不同电子供体驱动反硝化的脱氮效能及微生物响应特征尚不明确。本研究以乙酸、乙醇、乳酸和葡萄糖为代表性电子供体，在半连续活性污泥反硝化体系中开展长周期实验，结合16S rRNA高通量测序与微生物共现网络分析，研究不同电子供体供应下的反硝化效率与微生物响应特征。结果表明，不同电子供体类型调控反硝化脱氮效率，总体表现为乙酸体系最高，其次为乙醇和乳酸，葡萄糖体系最低。尽管各体系微生物群落结构总体相似，但主要的反硝化菌丰度分布存在显著差异：乙酸和乙醇组中以索氏菌属(Thauera)为主，葡萄糖组富集脱硝酸弯杆菌属(Denitratisoma)与Ellin6067，而乳酸组中动胶菌属(Zoogloea)为主要优势类群。网络分析进一步表明，电子供体类型通过影响微生物互作模式与关键物种功能，驱动反硝化效率差异。乙酸组形成紧密协作的网络，生丝微菌属(Hyphomicrobium)作为关键物种推动高效脱氮；乙醇组虽连接数多但模块间协作弱，限制了反硝化速率；乳酸组模块化程度高，依赖硫枝条菌属(Sulfuritalea)协调硫代谢以维持脱氮稳定；葡萄糖组中Ellin6067可能增强硝化作用，激化氨氧化菌与反硝化菌的竞争，导致脱氮效率最低。本研究从微生物生态学角度阐明了不同电子供体的反硝化效能及微生物响应特征，为有机废弃物衍生碳源的优化利用与污水处理低碳优化提供了科学依据。

• 利用家蚕几丁质结合蛋白CPAP3作为蛋白标签纯化重组蛋白

  申太霞，谭丽平，李佳慧，朱怡然，黄翊珂，侯勇

  昆虫中存在多种几丁质结合蛋白。其中，含有ChtBD2几丁质结合域的CPAP3蛋白家族是昆虫表皮中含量最为丰富的蛋白质种类之一，本研究旨在以昆虫几丁质结合蛋白为标签蛋白，探讨其在蛋白纯化领域的应用潜力，同时探究CPAP3蛋白结构域数量与其结合能力的关系。利用家蚕CPAP3-A蛋白(简称CPAP3)作为标签蛋白，以绿色荧光蛋白EGFP为目标蛋白，构建融合表达体系实现二者融合表达。以几丁质/壳聚糖材料作为固定相，通过结合实验验证融合蛋白的结合能力。结果显示，融合蛋白CPAP3-EGFP与4种不同的几丁质/壳聚糖均能发生结合。正交实验表明最佳结合条件为β-几丁质、结合缓冲液pH值6.5，此时吸附率高达70.44%左右。为进一步探究结构域数量与结合能力的关系，对CPAP3蛋白进行了截短处理。结果表明，含有3个结构域的蛋白结合能力显著高于其他2个截短组，说明蛋白标签的结合能力与结构域数量呈正相关。为了有效释放结合在几丁质上的目标EGFP蛋白，在目的蛋白与标签蛋白之间引入了TEV蛋白酶切序列。实验结果显示，TEV蛋白酶酶切后，蛋白在28 kDa处出现了新的条带，证实融合蛋白能够被TEV酶切开，目标蛋白得以释放至溶液上清中。本研究为昆虫几丁质结合蛋白作为亲和标签的应用提供了参考。

• 杀虫肽U10-MYRTX-Mri1a的抗菌活性验证及其酵母表达产物的活性评价

  刘婧文，宋佳，孙博，罗晓宏，闫雪，刘宽博，赵晨，张万忠

  我国“饲料禁抗、养殖减抗”政策实施后，新型抗生素替代产品的研发已成为迫切需求。在这种背景下，杀虫肽因具有功能多效性特征，且其杀虫活性与抗菌活性可能共享膜靶向机制，被认为是极具潜力的抗生素替代产品。本研究旨在验证源自欧洲红蚁毒液的杀虫肽U10-MYRTX-Mri1a的抗菌活性，并建立基于毕赤酵母表达系统的该肽生物合成平台，为开发抗生素替代产品提供实验依据与技术支持。基于“结构相似-功能跨界”的思路，本研究验证了U10-MYRTX-Mri1a对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抗菌活性。通过化学合成获得U10-MYRTX-Mri1a，测定其对2种致病菌的最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration, MIC)分别为16 μmol/L和8 μmol/L，最小杀菌浓度(minimum bactericidal concentration, MBC)均为16 μmol/L。扫描电镜观察到肽处理导致菌体膜结构塌陷和细胞碎裂。同时，本研究采用组成型启动子甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAP)，在毕赤酵母X33中表达融合肽U10-MYRTX-Mri1a-GNA，该融合肽对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌率分别为(89.37±2.22)%、(88.27±2.81)%，证明酵母表达的融合肽同样具有抗菌活性。上述研究结果初步证明杀虫肽U10-MYRTX-Mri1a是有抗生素替代潜力的天然产物，该结果拓宽了替抗产品来源。同时，成功建立的基于毕赤酵母生物合成肽平台，也为后续替抗研究与开发奠定了基础。

• 基于CRISPR-Cas13a的免扩增电化学生物传感器快速检测牛病毒性腹泻病毒

  李业，闻东亚，周赵凡，廖潮杰，赵倩，帅江冰，张晓峰，俞晓平，黄俊

  牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus, BVDV)是危害全球养牛业的重要病原体，可导致腹泻、发热及繁殖障碍，造成严重经济损失。建立快速、精准的BVDV检测方法对疫情防控具有重要意义。现有检测方法存在明显局限：PCR等核酸扩增技术需精密仪器且操作复杂；而CRISPR-Cas13a系统虽特异性强，却仍需核酸预扩增，导致检测流程繁琐和污染风险。为开发更简便高效的BVDV现场快速检测技术，本研究将CRISPR-Cas13a系统的特异性识别能力与电化学传感技术的高效信号转换特性相结合，建立了一种免核酸扩增的BVDV检测新方法。通过优化CRISPR RNA (crRNA)组合、反应缓冲液组分及Cas13a/crRNA浓度比等关键参数，该传感器检测限达3 090 copies/μL，较传统Cas13a荧光检测方法灵敏度提升4-5个数量级，可在35 min内完成从加样到结果输出的全过程。特异性实验表明，该方法仅对BVDV产生特异性检测信号，而对其他常见牛源病毒(包括对牛副流感病毒3型、牛呼吸道合胞病毒、蓝舌病病毒和口蹄疫病毒)均未产生可检测的交叉反应信号。22份临床样本验证结果显示，该传感器的特异性和灵敏度均达到100%。本研究建立的CRISPR-Cas13a电化学生物传感器具有免核酸扩增、操作简便等优势，为BVDV的现场快速检测提供了新型高效工具，在临床诊断和疫情防控中具有重要应用价值。